Les principaux sujets de recherche.

Notre recherche est essentiellement axée sur l'étude structurale des protéines sensibles à la pénicilline, telles que les

DD-peptidases (ou PBPs pour 'Penicillin-Binding Proteins') et les ß-lactamases. L'intérêt de ces enzymes réside dans le rôle crucial qu'elles jouent en thérapie antibactérienne. En effet, toutes les bactéries contiennent un assortiment de PBPs, intervenant à différents niveaux dans la régulation cellulaire, dans des réactions de transpeptidation, de carboxypeptidation et de transglycolysation. Ces protéines ont une masse moléculaire très variable, allant de 25000 à plus de 100000 daltons. Les PBPs de masse moléculaire élevée (HMW PBPs) seraient le résultat d'un certain schéma évolutif basé sur la fusion de différents modules. Ces HMW PBPs multifonctionnelles sont exposées sur la face externe de la membrane et constituent la machinerie principale de la synthèse du peptidoglycane pariétal (PBP1b d'Escherichia coli) ou font partie de réseaux morphogénétiques parfaitement régulés (PBP3 d'Escherichia coli, PBP3r d'Enterococcus hirae, ou encore PBP5 d'Enterococcus faecalis

L'inactivation des PBPs par les antibiotiques à noyau ß-lactame (ou ß-lactamines) provoque des dommages bactériens, et l'inhibition d'un seul type de PBP peut être fatal à la bactérie. Les PBPs sont sensibles à la pénicilline parce que la liaison amide endocyclique du cycle ß-lactame adopte une conformation comparable à celle de la liaison DAla-DAla de leurs substrats physiologiques.

Cependant, la pression exercée sur le monde bactérien par l'emploi massif et abusif des antibiotiques a provoqué la sélection de souches bactériennes résistantes de plus en plus nombreuses. Cette résistance est principalement due à la production par les bactéries d'enzymes, appelées ß-lactamases, capables d'hydrolyser la liaison amide du noyau ß-lactame, rendant ainsi l'antibiotique inefficace. Les ß-lactamases à sérine active sont regroupées en trois classes A, C et D sur base de leur séquence en acides aminés (Waley, 1992). Plusieurs observations supportent l'hypothèse, généralement admise, selon laquelle PBPs et ß-lactamases auraient évolués à partir d'une origine ancestrale commune (Ghuysen, 1994). En effet, outre de nombreuses similitudes entre leur séquence en acides aminés et leur structure tridimensionnelle, ces enzymes vérifient des modèles cinétiques analogues :

où E représente l'enzyme, S le substrat, ES le complexe de Henri-Michaelis, ES* l'intermédiaire covalent (l'acyl-enzyme), et P le produit final de la réaction. Les valeurs k1, k-1, k2 et k3 sont des constantes cinétiques de premier ordre. En ce qui concerne les interactions avec les ß-lactamines, l'étape de déacylation est évidemment beaucoup plus lente dans le cas des PBPs, ce qui confère à l'antibiotique son caractère d'inhibiteur.

La synthèse rationnelle de drogues formant des complexes suffisamment stables avec les PBPs et résistant aux ß-lactamases, requiert un maximum d'informations structurales. Actuellement, les structures cristallographiques de six ß-lactamases ont été déterminées à haute résolution. Parmi celles-ci, les ß-lactamases de classe A de Staphylococcus aureus PC1(Herzberg, 1991), de Bacillus licheniformis 749/C (Knox & Moews, 1991), de Streptomyces albus G (Dideberg et al., 1987 et résultats personnels), et de TEM1 d'Escherichia coli (Fonzé et al., 1995); et les ß-lactamases de classe C de Citrobacter freundi (Oefner et al., 1990) et d'Enterobacter cloacae P99 (Lobkovsky et al, 1993). Seules deux structures de PBPs sont connues à haute resolution : la DD-carboxypeptidase de Streptomyces R61 (Kelly & Kuzin, 1995) et la DD-transpeptidase de Streptomyces K15 (résultats personnels). Plus récemment, la structure d'un PBP de masse moléculaire élevée, PBP2x de Streptococcus pneumoniae, a été résolue à 3.5Å de résolution (Pares et al., 1996).

Afin d'accéder à une meilleure compréhension des mécanismes réactionnels, nous avons étendu notre champ d'investigation à l'étude de complexes avec des substrats et/ou inhibiteurs de mutants fondamentalement et/ou cliniquement intéressants, ainsi que d'autres représentants de la famille des enzymes reconnaissant la pénicilline.

Parmi les enzymes de type ß-lactamase, retenons celles qui sont déjà produites, purifiées, caractérisées biochimiquement, cristallisées et/ou en cours de cristallisation :

les mutants naturels, TEM10 et TEM18, de la ß-lactamase de classe A TEM1 d'Escherichia coli, responsables de l'émergence d'une résistance aux antibiotiques les plus récents tels que l'aztreonam et les céphalosporines de troisième génération (céfotaxime et ceftazidime).
Les mutants catalytiques dirigés de TEM1, S70A, S235A et R164S, dont les données cinétiques montrent que des complexes, suffisamment stable pour des études cristallographiques, peuvent être formés.
La ß-lactamase thermostable de classe A de Bacillus licheniformis, très similaire en séquence en acides aminés à la structure connue.
Les ß -lactamases de classe C d'Enterobacter cloacae 908R et d'Escherichia coli pour lesquelles nous possédons des mutants (respectivement S64C/S84C et E272V,Q/T316V,A/R349V) portant sur des résidus définissant la cavité enzymatique ou impliqués dans le maintien de sa géométrie, ou encore intervenant dans le positionnement des substrats. Toujours dans la classe C, une ß-lactamase "froide" de Pseudomonas fluorescens est en cours d'étude.
Une ß-lactamase de classe D , celle de Salmonella typhimurium ou OXA II. Ces enzymes d'environ 28 kDa présentent une nette préférence pour l'hydrolyse des oxacillines, et à ce jour, aucune structure de cette classe de ß-lactamase n'est connue.
La protéine/récepteur membranaire BlaR de Bacillus licheniformis, intervenant dans le phénomène d'induction de la synthèse d'une ß-lactamase. En fait, c'est la partie C-terminale (DLP ou senseur) qui lie la pénicilline et se déploie sur la face externe de la membrane cytoplasmique. Au niveau de la séquence en acides aminés de ce domaine DLP, on observe beaucoup de similarités avec les ß-lactamases de classe D, et plus particulièrement avec OXA II.

En ce qui concerne les DD-peptidases :

nous continuons l'étude de PBPs exocellulaires tels que la DD-carboxypeptidase de Streptomyces R61 et la DD-transpeptidase de Streptomyces K15, avec des enzymes mutants pour lesquels des complexes avec des analogues de substrat naturel (Diacétyl-L-Lys-D-Ala-D-Ala) pourraient être formés.
Pour les PBPs semi-membranaires de faibles poids moléculaire, des formes solubles de PBP5, 7 et 8 d'Escherichia coli sont produites. Des spectres de diffraction X du PBP5 à 3 Å de résolution sont en cours d'analyse.
Dans un projet de recherche avec la firme pharmaceutique ROUSSEL-UCLAF, nous nous proposons d'élucider diverses structures de PBPs de poids moléculaire élevé. Les protéines modèles choisies sont : (1) des PBPs cibles létales des ß-lactamines, avec PBP1b d'Escherichia coli et PBP1a de Mycobacterium leprae qui interviennent dans la formation de la paroi bactérienne, ainsi que PBP3 d'Escherichia coli et PBP3s d'Enterococcus hirae qui participent à la division cellulaire; (2) des PBPs de faible affinité pour les ß-lactamines, tels que PBP3r et PBP5 d'Enterococcus hirae, qui sont responsables d'un phénomène de résistance "intrinsèque" aux antibiotiques grâce à leur capacité de se substituer aux autres PBPs lorsque celles-ci sont inhibées par les antibiotiques.

Toujours dans le cadre d'applications thérapeutiques, mais cette fois antivirales, notre laboratoire participe aussi à

Les autres familles de protéines dont nous avons commencé l'étude cristallographique sont
représentées par :
Une alginate lyase de bactéries marines (en collaboration avec les équipes du Dr. B. Kloareg de l'Observatoire océanologique de Roscoff et du Dr. M. Guinand du Laboratoire de biochimie microbienne de l'Université Claude Bernard à Lyon).
Une N-acetyl-muramyl-L-Ala-amidase (AmpD) de Citrobacter freundii (en collaboration avec le Laboratoire d'enzymologie de l'Université de Liège).
Les sidérophores de Pseudomonas (en collaboration avec l'équipe du Pr. Thonart du CWBI de l'Université de Liège).
La xylanase Xyl1 de Streptomyces sp. S38, en vue d'étudier l'adaptation aux hautes températures d'une xylanase mésophile.

Références

: Dideberg, O., Charlier, P., Wéry, J-P., Dehottay, P., Dusart, J., Erpicum, T., Frère, J-M. and Ghuysen, J-M. (1987) Biochem. J., 245, 911-913.
Fonzé, E., Charlier, P., To'th, Y., Vermeire, M., Raquet, X., Dubus, A. and Frère, J-M. (1995) Acta Cryst., D51, 682-694.
Ghuysen, J-M. & Dive, G. (1994) Biochemistry of the penicilloyl serine transferases, ed. by Ghuysen and Hakenbeck, Elsevier Science, pp 103-129.
Herzberg, O. (1991) J. Mol. Biol., 217, 701-719.
Kelly, J. A. & Kuzin, A. P. (1995) J. Mol. Biol., 254, 223-236.
Knox, J. R. & Moews, P. C. (1991) J. Mol. Biol., 220, 435-455.
Lobkovsky, E., Moews, P. C., Hansong, L., Haiching, Z., Frère, J-M. and Knox, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 11257-11261.
Oefner, C., D'Arcy, A., Daly, J. J., Gubernator, K., Charnas, R. L., Heinze, I., Hubschwerlen, C. and Winkler, F. K. (1990) Nature, 343, 284-288.
Pares, S., Mouz, N., Pétillot, Y., Hackenbeck, R., Dideberg, O.(1996) Nature Structural biology, 3, 284-289.
Waley, S.G. (1992) ß -lactamase : mechanism of action. In The Chemistry of ß -lactams (Page, M. I., ed.), pp. 198-228, Chapman and Hall, Glasgow, UK.